胶原三股螺旋重复蛋白1基因真核表达载体的构建及其与microRNA-30b关系初探-周辉芳

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摘要:周辉芳，等．胶原三股螺旋重复蛋白１基因真核表达载体的构建及其与ｍｉｃｒｏＲＮＡ－３０ｂ关系初探３７７胶原三股螺旋重复蛋白１基因真核表达载体的构建及其与ｍｉｃｒｏＲＮＡ－３０ｂ关系初探周辉芳，，隗和儒，马士朝，张超群，王君平，杨新英，谢英，孙殿兴，１２１３２２２４１２１河北医科大学研究生学院，石家庄０５００１７；２中国人民解放军联勤保障部队第九八医院全军肝病中心，石家庄０５００８２；３承德医学院，河北承德０６７０００；４河北医科大学实验动物学部河北省实验动物重点实验室，石家庄０５００１７摘要：目的构建ｐＣＴＨＲＣ１－ＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ真核表达载体，初步探讨胶原三股螺旋重复蛋白１基因（ＣＴＨＲＣ１）与ｍｉｃｒｏＲＮＡ（简写为ｍｉＲ）－３０ｂ的关系。方法设计特异性引物，通过ＰＣＲ扩增合成含有ＣＴＨＲＣ１ＣＤＳ＋３′ＵＴＲ区的序列，并克隆至ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ真核表达载体，得到ｐＣＴＨＲＣ１－ＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ真核表达载体。采用ＮｈｅⅠ／ＸｈｏⅠ双酶切电泳和测序法进行鉴定；通过脂质体转染法转染Ｈｕｈ７及ＨｅｐＧ２细胞评价转染效率；将ｍｉＲ－３０ｂｍｉｍｉｃ、ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＣＴＨＲＣ１－ＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ质粒和ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ质粒转染至２９３Ｔ细胞中，分别采用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ和实时荧光定量ＰＣＲ法检测转染４８ｈ后ＣＴＨＲＣ１蛋白的表达水平及ｍｉＲ－３０ｂ的表达水平，初步探讨ＣＴＨＲＣ１基因与ｍｉＲ－３０ｂ的关系。两组间比较采用独立样本ｔ检验。采用ＮｈｅⅠ／ＸｈｏⅠ双酶切ｐＣＴＨＲＣ１－ＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ真核表达载体，得到５３００ｂｐ和１

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