典型的PCR操作

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摘要:PCR典型的操作在此处仅列出—般PCR操作过程，具体影响因素的优化将在本章第二节讨论，每一个具体操作前都需进行必要的优化。()一试剂(1)引物根据待扩增DNA不同，引物亦不同，引物的设计见本章第三节。(2)耐热DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温(93—100c)，不同耐热DNA聚合酶的特性详见本章第4节。Perkin—E1mer—cetus公司、N、F、Bio1ab、PharMacia公司、国内华美公司、复旦．大学和中国医学科学院友谊公司等均有商品供应。(3)10xPCR缓冲液：500mm01／LKCl；100mmol／LTris一HCl(pH8.4，20c)，150mmolLMgCl2lmgm1o““／，／明胶(4)5mmo1／LdNTP贮备液：将dATP，dCTP，dGTPT和dTTP钠盐各100mg合并，加3m1灭菌去离子水溶解，用NaoH调pH至中性，分装每份300v1，(-)20℃保c存dNTP浓度最好用uv吸收法精确测定。另外。现在已有中性dNTP溶液商品供应(SigmaPharmacia).公司和公司等(5)标本处理试剂：不同标本所需试剂不同，根据具体情况而定〔见本章第6节)G()二操作程序PcR利用扩增的操作程序基本相同，只是根据引物与靶序列的不同，选择不同的反应体系与循环参数(见本章第：：节)o基本的操作是将PcR必需反应成分加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。每个实验室或每个人都有不同的操作习惯，但需遵守一定的操作规范。我们推荐下述操作程序，因这样操作可最大程度地增加反应的成功率。(1)向

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